Protéomique et Spectrométrie de Masse des Biomolécules

Développements

Grâce à l’expertise du personnel de la plateforme et la mise en place de collaborations, nous avons engagé plusieurs programmes autour de développements technologiques et de stratégies innovantes dans différents domaines :

La caractérisation de modifications post-traductionnelles, de part leur nombre et leur diversité chimique, représente toujours un des enjeux actuels des approches protéomiques. Ces modifications, qui peuvent être transitoires, sont des éléments essentiels pour la fonction et le devenir des protéines dans la cellule. Nous travaillons depuis plusieurs années sur la caractérisation de sites de phoshorylation de différents systèmes biologiques, tels que le protéasome (Claverol et al., MCP 2002) et les phosphatases cdc25 (Bouché et al., JPR 2008 ; autres….). Nous avons développé une stratégie d’analyse complémentaire à l’analyse des peptides modifiés après digestion trypsique afin d’émettre des hypothèses sur la nature des modifications portées par la protéine. Cette approche est basée sur la combinaison d’une élution passive des protéines de gels d’acrylamide et de la mesure de la masse moléculaire de la protéine (Mol. Cell. Proteomics, 2003, 2, 483-493). Afin d’aller plus avant dans la compréhension du rôle des phosphorylations, nous poursuivons actuellement notre effort vers l’identification du phosphoprotéome ainsi que la mesure de ses variations en fonction de l’expression ou non de protéines impliquées dans des processus de cancérisation.

Le développement du couplage BIA-MS permet d’identifier par spectrométrie de masse des molécules issues de préparations cellulaires ayant interagi avec un partenaire connu, qui est immobilisé sur le "sensorchip" du Biacore. Désormais, la mise au point de la technologie BIA-MS permet d’envisager l’identification de partenaires pour des quantités de protéines de l’ordre de la dizaine de femtomoles (Proteomics, 2003, 3, 402-412). Ce travail représente la première intégration directe de la fonction "recovery" du système commercial Biacore 3000 dans une démarche d’identification.

La caractérisation de modifications post-traductionnelles, de part leur nombre et leur diversité chimique, représente toujours un des enjeux actuels des approches protéomiques. Nous avons mis au point une méthode d'élution de protéines entières à partir de gels d'acrylamide compatible avec une analyse par spectrométrie de masse. Complémentaire des approches classiques "bottom-up", cette approche de type "top-down" permet d'effectuer une mesure de la masse moléculaire de la protéine éluée et d'émettre des hypothèses sur d'éventuelles modifications post-traductionnelles (Mol.Cell. Proteomics, 2003, 2, 483-493).

L'analyse quantitative fait également partie des défis actuels en protéomique. Nous avons adapté la stratégie de marquage isotopique des protéines par les réactifs ICAT (Isotope Coded Affinity Tag) à une séparation de faibles quantités de protéines par gels 2D suivie d'une analyse par spectrométrie de masse (Proteomics, 2005, 5, 2351-2363). Par ailleurs, nous mettons en place des stratégies basées sur des marquages isotopiques en milieux de culture (14N/15N et SILAC) pour l'analyse de mélanges complexes de protéines.

L’analyse de mélanges complexes et l’accès aux protéines minoritaires représentent des verrous technologiques des approches protéomiques. Associée aux stratégies de fractionnement cellulaire et de chromatographie multidimensionnelle, l’analyse de mélanges complexes par électrophorèse 1D et analyse systématique de l’ensemble du gel divisé en n bandes par couplage nanoLC-MS/MS représente une stratégie puissante qui permet d’accéder à une couverture analytique maximale. Palliant aux limitations de l’électrophorèse 2D (pI et PM extrêmes, protéines hydrophobes…), cette approche associée à de nouvelles stratégies d’analyse quantitative (ICAT, ITRAQ, SILAC …) est un outil de choix pour l’analyse de mélange complexes. L’analyse des données obtenues par ce type d’approche demande cependant le développement d’outils bioinformatiques adaptés pour accélérer la validation des résultats à grande échelle.

La plate-forme s’est particulièrement investie depuis 2003 dans la mise en place et le développement d’un outil de gestion et de traçabilité des données à travers un LIMS (Laboratory Informatic Management System) répondant aux besoins de la plate-forme. Par ailleurs, devant l’absence d’outils suffisamment fiables dans la validation des données issues de la spectrométrie de masse nous développons, à partir d’un outil commercial ("Mascot File Parser"), un logiciel permettant d’accélérer la validation des résultats d'identification des protéines, en particulier à partir de mélanges complexes. Parallèlement, nous développons un outil informatique permettant de gérer efficacement les données quantitatives des approches utilisant des marquages isotopiques de type ICAT, SILAC ou ¹⁴N/¹⁵N.

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