Préparation des échantillons avant
analyse en spectrométrie de masse
1. Attention à la kératine !!!
 Porter une blouse.
Attacher les cheveux longs.
Porter des gants lavés à l’eau chaude et au savon puis à l’eau milliQ.
Tous les récipients utilisés doivent être rincés plusieurs fois à
l’eau milliQ.
Les embouts de pipettes doivent être rincés par plusieurs
pipetages dans l’eau milliQ Utiliser
de préférence des tubes eppendorf Biopur (Ref.Eppendorf : 00 30 121.589).
2. Pour la réalisation du gel
L’important est d’avoir un maximum de protéine dans un minimum de
gel
Utilisez des gels de faible épaisseur (0,75 mm).
N’oubliez pas de charger les puits vides avec du tampon Laemmli
pour limiter la diffusion des protéines sur les côtés lors de la
migration.
Signalez-nous les éventuelles modifications des cystéines (carbamidométhylation
ou carboxyméthylation).
3. Pour la coloration du gel
Ne surtout pas utiliser des boites qui servent à des manip de
Western Blott !
Préférez la coloration au bleu de Coomassie à celle au nitrate
d’argent
(la limite de détection d’une bonne coloration au bleu de Coomassie
est de 20 ng).
Notre protocole :
Dès la fin de la migration : fixation des protéines par 2 bains de
30 min minimum dans
Ac.acétique 7,5% / éthanol 30% .
60 min dans « Coomassie stain solution » de BioRad (Réf. BioRad
161-0436).
Décoloration par plusieurs bains dans éthanol 30% jusqu'à obtenir
le contraste optimum.
4. Pour la découpe des bandes ou des
spots de gel
Porter des gants lavés à l’eau chaude et au savon puis rincés à
l’eau milliQ.
Laver une plaque de verre à l’eau chaude et au savon, la rincer
abondamment à l’eau milliQ puis à l’éthanol.
Le gel est ensuite déposé sur la plaque (qui peut-être placée sur
une table lumineuse afin de bien visualiser la bande ou le spot à
découper).
La bande ou le spot doit être découpé le plus finement possible de
façon à éviter de prendre plusieurs bandes (contaminations) et
surtout de façon à avoir le moins de gel possible (dilution de la
protéine diminue le signal en masse) : mieux vaut perdre un peu de
protéine que de découper des trop gros morceaux de gel ! ! !
La bande ou le spot sera ensuite mis dans un tube
Eppendorf Biopur
de 1,5mL.
(On pourra s’aider d’une petite spatule pour transvaser le morceau
de gel dans le tube à condition qu’elle soit lavée au savon et
rincée à l’éthanol avant chaque morceau.)
5. Conservation et stockage pour envoi
Le morceau de gel sera conservé à –4 ºC dans un tube
Eppendorf
rempli d’éthanol 10%.
Envoi à température ambiante en prenant soin de bien protéger les
tubes contre les chocs (plastique à bulles, boite…).
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